Objectivos de aprendizagem
- Comparar a aglutinação direta e indireta
- Identificar as várias utilizações da hemaglutinação no diagnóstico de doenças
- Explicar como são determinados os tipos de sangue
- Explicar as etapas utilizadas para efetuar a compatibilidade cruzada do sangue a utilizar numa transfusão
Para além de causarem a precipitação de moléculas solúveis e a floculação de moléculas em suspensão, os anticorpos também podem aglomerar células ou partículas (por exemplo, esferas de látex revestidas com antigénio) num processo denominado aglutinação (A aglutinação pode ser utilizada como um indicador da presença de anticorpos contra bactérias ou glóbulos vermelhos. Os ensaios de aglutinação são normalmente rápidos e fáceis de efetuar numa lâmina de vidro ou placa de microtítulo (As placas de microtitulação têm uma série de poços para conter pequenos volumes de reagentes e para observar as reacções (por exemplo, aglutinação) visualmente ou utilizando um espetrofotómetro especialmente concebido para o efeito. Os poços existem em muitos tamanhos diferentes para ensaios que envolvem diferentes volumes de reagentes.
Figura 1: As placas de microtitulação são utilizadas para conduzir numerosas reacções em simultâneo numa série de poços (crédito: modificação do trabalho de "Microrao"/Wikimedia)
Aglutinação de bactérias e vírus
A utilização de testes de aglutinação para identificar bactérias estreptocócicas foi desenvolvida na década de 1920 por Rebecca Lancefield trabalhando com os seus colegas A.R. Dochez e Oswald Avery .[1] Utilizou anticorpos para identificar Proteína M A produção de anticorpos contra a proteína M é crucial para a montagem de uma resposta protetora contra a bactéria.
Lancefield utilizou anti-soros para demonstrar que diferentes estirpes da mesma espécie de estreptococos expressam diferentes versões da proteína M, o que explica o facto de as crianças poderem faringite estreptocócica Lancefield classificou repetidamente os estreptococos beta-hemolíticos em vários grupos com base nas diferenças antigénicas dos polissacáridos específicos de cada grupo localizados na parede celular bacteriana. sorovares A identificação dos serovares presentes num surto de doença é importante porque alguns serovares podem causar uma doença mais grave do que outros.
Figura 2. Anticorpos contra seis serovares diferentes de estreptococos do Grupo A foram ligados a esferas de látex. Cada uma das seis preparações de anticorpos foi misturada com bactérias isoladas de um doente. Os pequenos aglomerados observados no poço 4 são indicativos de aglutinação, que está ausente em todos os outros poços. Isto indica que o serovar associado ao poço 4 está presente na amostra do doente. (crédito: modificaçãode trabalho da Sociedade Americana de Microbiologia)
O método desenvolvido por Lancefield é um ensaio de aglutinação direta Uma estratégia semelhante é mais comummente utilizada hoje em dia para identificar serovares de bactérias e vírus; no entanto, para melhorar a visualização da aglutinação, os anticorpos podem ser ligados a contas de látex Esta técnica é designada por ensaio de aglutinação indireta (ou ensaio de fixação do látex Os ensaios indirectos podem ser utilizados para detetar a presença de anticorpos ou de antigénios específicos.
Para identificar os anticorpos no soro de um doente, o antigénio de interesse é ligado a esferas de látex. Quando misturados com o soro do doente, os anticorpos ligam-se ao antigénio, fazendo com que as esferas de látex se aglutinem indiretamente, o que indica a presença do anticorpo (Figura 3). Esta técnica é mais frequentemente utilizada quando se procura IgM Um exemplo amplamente utilizado deste ensaio é um teste para detetar a presença de anticorpos antigénicos, uma vez que a sua estrutura proporciona uma ligação cruzada máxima. fator reumatoide (FR) A FR é, de facto, a presença de anticorpos IgM que se ligam à própria IgG . RF aglutinará as esferas de látex revestidas com IgG.
No teste inverso, os antigénios solúveis podem ser detectados no soro de um doente ligando anticorpos específicos (normalmente mAbs) às esferas de látex e misturando este complexo com o soro (Figura 3).
Figura 3. (a) As esferas de látex revestidas com um antigénio aglutinam-se quando misturadas com o soro do doente se o soro contiver anticorpos IgM contra o antigénio. (b) As esferas de látex revestidas com anticorpos aglutinam-se quando misturadas com o soro do doente se o soro contiver antigénios específicos dos anticorpos.
Os testes de aglutinação são amplamente utilizados em países subdesenvolvidos que podem não dispor de instalações adequadas para a cultura de bactérias. Ensaio Widal utilizado para o diagnóstico de febre tifoide procura a aglutinação de Salmonella enterica subespécie tifo O teste de Widal é rápido, barato e útil para monitorizar a extensão de um surto; no entanto, não é tão preciso como os testes que envolvem a cultura da bactéria. O teste de Widal produz frequentemente falsos positivos em doentes com infecções anteriores com outras subespécies de Salmonela bem como falsos negativos em doentes com hiperproteinemia ou deficiências imunitárias.
Além disso, os testes de aglutinação são limitados pelo facto de os doentes geralmente não produzirem níveis detectáveis de anticorpos durante a primeira semana (ou mais) de uma infeção. Diz-se que um doente foi submetido a seroconversão Normalmente, a seroconversão coincide com o aparecimento de sinais e sintomas da doença. No entanto, numa infeção por VIH, por exemplo, são geralmente necessárias 3 semanas para que a seroconversão ocorra e, em alguns casos, pode demorar muito mais tempo.
À semelhança das técnicas para o teste do anel de precipitina e para os ensaios em placa, é rotina preparar diluições duplas em série do soro do doente e determinar o título de anticorpo aglutinante presente. Uma vez que os níveis de anticorpos se alteram ao longo do tempo, tanto nas respostas imunitárias primárias como secundárias, ao verificar as amostras ao longo do tempo, podem ser detectadas alterações no título de anticorpos. título durante o fase aguda de uma infeção versus o título do fase de convalescença Também é possível monitorizar a forma como o sistema imunitário do doente está a responder ao agente patogénico.
Veja este vídeo que demonstra reacções de aglutinação com esferas de látex.
Pensar no assunto
- Como é que a aglutinação é utilizada para distinguir os serovares uns dos outros?
- Num ensaio de esferas de látex para testar anticorpos no soro de um doente, com que são revestidas as esferas?
- O que é que acontece quando um doente sofre uma seroconversão?
Hemaglutinação
A aglutinação de glóbulos vermelhos é designada por hemaglutinação Um ensaio comum que utiliza a hemaglutinação é o teste direto de Coombs , também designado por teste direto de globulina anti-humana (DAT) O teste também pode detetar o complemento ligado aos glóbulos vermelhos.
O teste de Coombs é frequentemente utilizado quando um recém-nascido tem iterícia O teste de Coombs é utilizado para determinar se os glóbulos vermelhos da criança foram ligados pelos anticorpos da mãe. Estes anticorpos activariam o complemento, levando à lise dos glóbulos vermelhos e à iterícia subsequente. Outras condições que podem causar um teste direto positivoOs testes de Coombs incluem reacções transfusionais hemolíticas , anemia hemolítica autoimune , mononucleose infecciosa (causada por Vírus Epstein-Barr ), sífilis e Mycoplasma pneumonia Uma prova de Coombs direta positiva pode também ser observada em alguns cancros e como reação alérgica a alguns medicamentos (por exemplo, penicilina).
Os anticorpos ligados aos glóbulos vermelhos nestas condições são, na maioria das vezes IgG e devido à orientação dos locais de ligação ao antigénio na IgG e ao tamanho comparativamente grande de um glóbulo vermelho, é improvável que ocorra qualquer aglutinação visível. No entanto, a presença de IgG ligada aos glóbulos vermelhos pode ser detectada através da adição de Reagente de Coombs O reagente de Coombs liga as IgG ligadas aos glóbulos vermelhos vizinhos, promovendo assim a aglutinação.
Existe também um teste de Coombs indireto conhecido como o teste indireto de antiglobulina (IAT) Esta técnica permite detetar anticorpos contra antigénios dos glóbulos vermelhos (que não os antigénios A e B) que não estão ligados no soro do doente (Figura 4). A TIA pode ser utilizada para detetar anticorpos que possam causar doença hemolítica do recém-nascido Também pode ser utilizado antes da administração de transfusões sanguíneas. Mais pormenores sobre a forma como o IAT é realizado são discutidos abaixo.
Figura 4 - Clique para aumentar a imagem. As etapas dos testes de Coombs direto e indireto são mostradas na ilustração.
Os anticorpos que se ligam aos glóbulos vermelhos não são a única causa de hemaglutinação. Alguns vírus também se ligam aos glóbulos vermelhos, e esta ligação pode causar aglutinação quando os vírus se ligam de forma cruzada aos glóbulos vermelhos. Por exemplo, vírus da gripe têm dois tipos diferentes de picos virais chamados neuraminidase (N) e hemaglutinina (Assim, podemos utilizar os glóbulos vermelhos para detetar a presença do vírus da gripe através de ensaios de hemaglutinação direta (HA), em que o vírus provoca uma aglutinação visível dos glóbulos vermelhos do sangue. papeira e rubéola os vírus também podem ser detectados utilizando HA.
Mais frequentemente, um diluição em série O ensaio de aglutinação viral é utilizado para medir a título O título viral pode ser determinado utilizando uma HA direta, efectuando uma diluição em série da amostra que contém o vírus, começando com uma concentração elevada da amostra que é depois diluída numa série de poços. A diluição mais elevada que produz aglutinação visível é o título. O ensaio é efectuado numa placa de microtítuloNa presença de vírus aglutinantes, os eritrócitos e o vírus aglomeram-se e formam um tapete difuso no fundo do poço. Na ausência de vírus, os eritrócitos rolam ou sedimentam no fundo do poço e formam um pellet denso, razão pela qual os poços de fundo plano não podem ser utilizados (Figura 5).
Figura 5. Uma suspensão viral é misturada com uma quantidade padronizada de glóbulos vermelhos. Não é visível qualquer aglutinação de glóbulos vermelhos quando o vírus está ausente e as células formam um pellet compacto no fundo do poço. Na presença de vírus, forma-se um precipitado rosa difuso no poço. (crédito inferior: modificação do trabalho da American Society for Microbiology)
A presença destes anticorpos no soro de um doente ou num antissoro produzido em laboratório neutraliza o vírus e impede-o de aglutinar os eritrócitos, o que faz com que este ensaio seja um ensaio de inibição da hemaglutinação viral (Neste ensaio, o soro do doente é misturado com uma quantidade padronizada de vírus. Após uma breve incubação, é adicionada uma quantidade padronizada de glóbulos vermelhos e observa-se a hemaglutinação. O título do soro do doente é a diluição mais elevada que bloqueia a aglutinação (Figura 6).
Figura 6: Nesta AIS, o soro contendo anticorpos contra o vírus influenzavírus foi submetido a diluições seriadas de duas vezes numa placa de microtitulação. Em seguida, foram adicionados glóbulos vermelhos aos poços. A aglutinação só ocorreu nos poços em que os anticorpos estavam demasiado diluídos para neutralizar o vírus. A concentração mais elevada em que ocorre a aglutinação é o título dos anticorpos no soro do doente. NaNo caso deste teste, a Amostra A apresenta um título de 128 e a Amostra C apresenta um título de 64. (crédito: modificação do trabalho de Evan Burkala)
Pensar no assunto
- Qual é o mecanismo pelo qual os vírus são detectados num ensaio de hemaglutinação?
- Qual é o resultado da hemaglutinação que nos indica o título do vírus numa amostra?
Animais em laboratório
Muito do que sabemos hoje sobre o sistema imunitário humano foi aprendido através da investigação realizada com animais - principalmente mamíferos - como modelos. Para além da investigação, os mamíferos são também utilizados para a produção da maioria dos anticorpos e outros componentes do sistema imunitário necessários para o imunodiagnóstico. As vacinas, os diagnósticos, as terapias e a medicina translacional em geral foram todos desenvolvidos através deinvestigação com modelos animais.
Considere algumas das utilizações comuns de animais de laboratório para a produção de componentes do sistema imunitário. As cobaias são utilizadas como fonte de complemento e os ratos são a principal fonte de células para a produção de mAbs. Estes mAbs podem ser utilizados na investigação e para fins terapêuticos. Os anti-soros são criados numa variedade de espécies, incluindo cavalos, ovelhas, cabras e coelhos. Ao produzir um antissoro, o animalOs animais de maior porte utilizados para a produção de anti-soros podem ter o sangue colhido repetidamente durante longos períodos de tempo, com poucos danos para os animais, mas esse não é normalmente o caso dos coelhos. Embora possamos obter alguns mililitros de sangue das veias auriculares dos coelhos, normalmente precisamos de volumes maiores, queresulta na morte dos animais.
Também usamos animais para o estudo de doenças. A única maneira de crescer Treponema pallidum Muitos vírus podem ser cultivados em cultura de células, mas o crescimento em cultura de células diz-nos muito pouco sobre a forma como o sistema imunitário responderá ao vírus. Quando trabalhamos numa doença recém-descoberta, continuamos a empregar os postulados de Koch, que requerem que se provoque a doença em animais de laboratório usando agentes patogénicos de cultura pura como um passo crucial para provar que um determinado vírus é um vírus.Estudar a proliferação de bactérias e vírus em hospedeiros animais e a forma como o sistema imunitário do hospedeiro reage tem sido fundamental para a investigação microbiológica há mais de 100 anos.
Embora a prática da utilização de animais de laboratório seja essencial para a investigação científica e o diagnóstico médico, muitas pessoas opõem-se fortemente à exploração de animais para benefício humano. Este argumento ético não é novo - de facto, uma das filhas de Charles Darwin era uma antivivisseccionista ativa (a vivissecção é a prática de cortar ou dissecar um animal vivo para o estudar).As considerações éticas levaram os Institutos Nacionais de Saúde (NIH) a desenvolver regulamentos rigorosos sobre os tipos de investigação que podem ser realizados. Estes regulamentos também incluem directrizes para o tratamento humano dos animais de laboratório, estabelecendo normas para o seu alojamento, cuidados eO documento do NIH "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (Guia para o Cuidado e Utilização de Animais de Laboratório) deixa claro que a utilização de animais na investigação é um privilégio concedido pela sociedade aos investigadores.
As directrizes dos NIH baseiam-se no princípio dos três R's: substituir, aperfeiçoar e reduzir. Os investigadores devem esforçar-se por substituir modelos animais com modelos não vivos, substituir vertebrados com invertebrados sempre que possível, ou utilizar modelos informáticos quando aplicável. Devem refinar a criação de animais e os procedimentos experimentais para reduzir a dor e o sofrimento, e utilizar concepções e procedimentos experimentais que reduzir Para obter financiamento, os investigadores têm de convencer os revisores dos NIH de que a investigação justifica a utilização de animais e de que a sua utilização está de acordo com as directrizes.
A nível local, qualquer instalação que utilize animais e receba financiamento federal deve ter um Comité Institucional de Cuidados e Utilização de Animais (IACUC) que garanta que as directrizes dos NIH estão a ser seguidas. O IACUC deve incluir investigadores, administradores, um veterinário e, pelo menos, uma pessoa sem ligações à instituição, ou seja, um cidadão interessado. Este comité também efectua inspecções deNo caso de investigação que envolva seres humanos, um Conselho de Revisão Institucional (IRB) assegura o cumprimento das directrizes adequadas.
Visite este sítio para ver o Guia dos NIH para o Cuidado e Utilização de Animais de Laboratório.Tipagem sanguínea e compatibilidade cruzada
Para além dos anticorpos contra bactérias e vírus a que foram previamente expostos, a maioria dos indivíduos também é portadora de anticorpos contra tipos sanguíneos Atualmente, existem 33 sistemas de tipos sanguíneos imunologicamente importantes, muitos dos quais são restritos a vários grupos étnicos ou raramente resultam na produção de anticorpos. Os mais importantes e talvez mais conhecidos são os ABO e Grupos sanguíneos Rh (ver Figura 3 em Hipersensibilidades).
Quando as unidades de sangue estão a ser consideradas para transfusão Para a unidade de sangue, os anticorpos comercialmente preparados contra os antigénios A, B e Rh são misturados com os glóbulos vermelhos das unidades para confirmar inicialmente que o tipo de sangue na unidade é exato. Uma vez solicitada uma unidade de sangue para transfusão, é de importância vital garantir que o dador (unidade de sangue) e o recetor (doente) sãoAlém de confirmar o tipo de sangue da unidade, o tipo de sangue do paciente também é confirmado usando os mesmos anticorpos comercialmente preparados para A, B e Rh. Por exemplo, como mostrado na Figura 7, se o sangue do doador for A positivo, ele aglutinará com o antissoro anti-A e com o antissoro anti-Rh. Se não for observada aglutinação com nenhum dos anticorpos, o paciente será capaz de se aglutinar com o antissoro anti-Rh.o tipo de sangue seria O-negativo.
Após a determinação do tipo de sangue, imediatamente antes de libertar o sangue para transfusão, um correspondência cruzada é realizada em que uma pequena alíquota dos glóbulos vermelhos do dador é misturada com soro do paciente que aguarda a transfusão. Se o paciente tiver anticorpos contra os glóbulos vermelhos do dador, hemaglutinação Para confirmar quaisquer resultados negativos de testes e verificar se existem glóbulos vermelhos sensibilizados, Reagente de Coombs pode ser adicionado à mistura para facilitar a visualização da interação anticorpo-glóbulos vermelhos.
Em algumas circunstâncias, pode também ser efectuada uma prova de compatibilidade cruzada menor. Neste ensaio, uma pequena alíquota de soro do dador é misturada com glóbulos vermelhos do doente, o que permite a deteção de anticorpos aglutinantes no soro do dador. Esta prova é raramente necessária, porque as transfusões utilizam geralmente concentrados de glóbulos vermelhos com a maior parte do plasma removido por centrifugação.
Os glóbulos vermelhos têm muitos outros antigénios para além dos ABO e Rh. Embora seja pouco provável que a maioria das pessoas tenha anticorpos contra estes antigénios, as mulheres que tiveram gravidezes múltiplas ou os doentes que receberam múltiplas transfusões podem tê-los devido à exposição repetida. rastreio de anticorpos O soro do doente é verificado em comparação com glóbulos vermelhos do tipo O, preparados comercialmente, que expressam estes antigénios. Se ocorrer aglutinação, o antigénio ao qual o doente está a responder tem de ser identificado e tem de se determinar que não está presente na unidade dadora.
Figura 7: Esta amostra de um cartão de "cabeceira" produzido comercialmente permite a tipagem rápida do sangue do recetor e do dador antes da transfusão. O cartão contém três locais de reação ou poços. Um está revestido com um anticorpo anti-A, outro com um anticorpo anti-B e outro com um anticorpo anti-Rh. A aglutinação de glóbulos vermelhos num determinado local indica uma identificação positiva do sangueantigénios: neste caso, os antigénios A e Rh para o tipo de sangue A-positivo.
Pensar no assunto
- Se o sangue de um doente aglutinar com soro anti-B, qual é o tipo de sangue do doente?
- O que é um ensaio de compatibilidade cruzada e por que razão é efectuado?
O Quadro 1 resume os vários tipos de ensaios de aglutinação abordados nesta secção.
| Tabela 1: Mecanismos de ensaios seleccionados de anticorpo-antigénio | ||
|---|---|---|
| Tipo de ensaio | Mecanismo | Exemplo |
| Aglutinação | Direto: O anticorpo é utilizado para agregar células bacterianas ou outras estruturas grandes | Serotipagem de bactérias |
| Indireto: As esferas de látex são acopladas ao antigénio ou ao anticorpo para procurar o anticorpo ou o antigénio, respetivamente, no soro do doente | Confirmação da presença do fator reumatoide (IgM de ligação) no soro do doente | |
| Hemaglutinação | Direto: Algumas bactérias e vírus ligam os glóbulos vermelhos e aglomeram-nos | Diagnóstico da gripe, papeira e sarampo |
| Teste direto de Coombs (DAT): Detecta anticorpos não aglutinantes ou proteínas do complemento nos glóbulos vermelhos in vivo | Verificação da ligação dos anticorpos maternos aos glóbulos vermelhos neonatais | |
| Prova de Coombs indireta (TCI): Pesquisa anticorpos contra antigénios dos glóbulos vermelhos (que não os antigénios A e B) não ligados no soro de um doente in vitro | Realização de análises sanguíneas pré-transfusionais | |
| Inibição da hemaglutinação viral: Utiliza anticorpos de um doente para inibir a aglutinação viral | Diagnóstico de várias doenças virais pela presença de anticorpos do paciente contra o vírus | |
| Tipagem sanguínea e compatibilidade cruzada: Detecta ABO, Rh e antigénios menores no sangue | Corresponde o sangue do dador às necessidades imunitárias do recetor | |
Conceitos-chave e resumo
- Os anticorpos podem aglutinar células ou partículas grandes numa matriz visível. Aglutinação os testes são frequentemente efectuados em cartões ou em placas de microtítulo que permitem a ocorrência de múltiplas reacções lado a lado, utilizando pequenos volumes de reagentes.
- A utilização de anti-soros contra determinadas proteínas permite a identificação de sorovares dentro das espécies de bactérias.
- A deteção de anticorpos contra um agente patogénico pode ser uma ferramenta poderosa para o diagnóstico de doenças, mas há um período de tempo antes de os doentes passarem por seroconversão e o nível de anticorpos torna-se detetável.
- Aglutinação de esferas de látex em ensaios de aglutinação indireta pode ser utilizado para detetar a presença de antigénios específicos ou de anticorpos específicos no soro do doente.
- A presença de alguns anticorpos antibacterianos e antivirais pode ser confirmada pela utilização do teste direto de Teste de Coombs que utiliza o reagente de Coombs para reticular os anticorpos ligados aos glóbulos vermelhos e facilitar hemaglutinação .
- Alguns vírus e bactérias ligam-se e aglutinam os glóbulos vermelhos; esta interação é a base da ensaio de hemaglutinação direta O método mais frequentemente utilizado para determinar o título do vírus em solução.
- Ensaios de neutralização quantificar o nível de anticorpos específicos do vírus, medindo a diminuição da hemaglutinação observada após a mistura do soro do doente com uma quantidade padronizada de vírus.
- Os ensaios de hemaglutinação são também utilizados para rastrear e correspondência cruzada sangue do dador e do recetor para garantir que o recetor da transfusão não tem anticorpos contra antigénios do sangue doado.